Болезни и вредители растений

Основные болезни и вредители растений.

Болезни растений

Под болезнями растений понимается сложный патологический процесс, происходящий в растениях, сопровождающийся нарушением их физиологических функций, изменением структуры, снижением продуктивности и зависящий от свойств растений, возбудителей болезней и условий окружающей среды. В результате болезни задерживается рост и развитие растений, происходит отмирание отдельных частей и органов, а нередко и гибель всего растения.

Заболевания могут быть местные и общие. Местное заболевание характеризуется поражением отдельных органов или их частей — листьев, цветов, стеблей. При общем заболевании болезнь распространяется диффузно, обычно по сосудистой ткани, и часто приводит к гибели всё растение.

В зависимости от причин все болезни делят на две группы — непаразитарные, или неинфекционные, вызываемые факторами неживой природы (состав почвы, температура, влажность), и паразитарные, или инфекционные, вызываемые факторами живой природы (грибы, бактерии, вирусы и цветковые растения—паразиты).

Для распознавания болезней необходимо знать их отличительные признаки.

Болезни растений весьма многообразны, однако их можно свести к следующим основным типам.

Основные типы болезней растений.

Гнили.

Гнили

При загнивании растений происходит растворение межклеточного вещества, а также оболочек клеток. При этом поражённые ткани и органы растений превращаются в кашицеобразную или сухую порошащуюся массу (гнили плодов, корнеплодов и древесины). Гнили вызываются грибами и бактериями.

Увядание.

Увядание

Характеризуется тем, что всё растение или отдельные органы его теряют тургор, увядают и засыхают. Это объясняется недостатком или полным прекращением доступа воды в растение. Недостаток или прекращение подачи воды может произойти вследствие разрушения или закупорки грибами и бактериями проводящей ткани растения. Часто увядание вызывается цветковыми паразитами, которые отнимают у растения воду и питательные вещества.

Налёты.

Налёты

Образуются чаще на листьях, могут быть на побегах и плодах. Представляют собой грибницу и спороношение паразита, покрывающие поражённую поверхность сплошь или отдельными участками. Болезни этого типа вызываются мучнисторосяными, ложномучнисторосяными и несовершенными грибами (например, мучнистая роса дуба, клена) или возникают от оседания пыли, копоти, сажи.

Некрозы или отмирание тканей и органов растений.

Некрозы или отмирание тканей и органов растений

Эти болезни возникают в результате местного поражения ткани или отмирания отдельных органов растений. Они могут быть вызваны грибами, бактериями, вирусами и причинами неинфекционного характера. Сюда включаются пятнистость листьев, плодов и ветвей, засыхание и пожелтение листьев и хвои, ожоги побегов, цветов, плодов, рак стволов и ветвей.

Деформация органов растений.

Деформация органов растений

К этому типу относятся курчавость листьев, различные искривления, образование разрывов тканей, трещин, наплывов, ведьминых метёл. Все эти изменения могут быть вызваны возбудителями болезней и неинфекционными причинами. К деформации также относят кармашки слив и мумификацию плодов и семян, вызываемых различными грибами.

Камедетечение (гоммоз) и слизетечение.

Камедетечение (гоммоз) и слизетечение

При этом типе болезней происходит постепенное разрушение и растворение оболочек клеток, с превращением содержимого клетки в жидкость, вытекающую из мест поражения, часто клейкую, постепенно застывающую (камедь). Камедетечение и слизетечение наблюдаются главным образом на стволах, ветвях или стеблях и являются результатом физиологических изменений, происходящих в растениях под воздействием грибов, бактерий и других причин, например камедетечение косточковых или слизетечение лиственных древесных пород.

Пустулы.

Пустулы

Представляют собой подушковидные или слегка приподнятые над субстратом образования, возникающие в результате спороношения некоторых грибов, например ржавчинных.

Болезни непаразитарные.

Болезни непаразитарные

К этой группе относятся заболевания, вызываемые неблагоприятными климатическими и почвенными условиями, механическими повреждениями и действием ядовитых газов, дыма, копоти и пыли, содержащихся в воздухе, особенно в условиях городов и фабричных посёлков. При воздействии этих факторов наблюдаются образование пятнистостей и налётов на листьях и побегах, засыхание листьев и хвои, увядание и гибель сеянцев и однолетних побегов, отмирание и усыхание побегов и вершин деревьев, ожоги коры, образование ран на стволах, ветвях.

Так, повреждения насаждений в городах вызываются вредными примесями в воздухе, в частности сернистого газа, который вызывает отмирание листьев и хвои у древесных пород и кустарников. При соприкосновении с влажным воздухом (особенно в дождливую погоду) сернистый газ частично превращается в серную и сернистую кислоты, попадает в почву, где повреждает корни растений. Гибель листьев и повреждение корневой системы приводят к усыханию и отмиранию побегов, ветвей, вершин деревьев, а иногда погибает целиком всё растение.

Оседание сажи, копоти на растениях вызывает образование налётов, при значительном слое которых происходит нарушение фотосинтеза и ассимиляции.

Часто встречаются заболевания непаразитарного характера, вызываемые действием высоких и низких температур. При ранних осенних заморозках погибают невызревшие одногодичные побеги древесных пород. От поздних весенних заморозков сильно страдают плодовые деревья. В суровые зимы некоторые плодовые погибают полностью.

Древесные породы — клён, ясень, граб, бук — часто страдают от обмораживания коры стволов и ветвей. В местах поражения кора и камбий погибают, кора отпадает и обнажается древесина. Позднее вокруг ран образуются наплывы вследствие деления здоровых камбиальных клеток. При действии морозов в последующие зимы эта ткань также может повреждаться и разрушаться, а вокруг неё вновь будут образовываться наплывы. Обнажённый участок древесины из года в год увеличивается. Подобные образования на стволах деревьев называются открытым морозобойным раком.

Ожог коры происходит в результате сильного нагревания ствола солнечными лучами (чаще с южной стороны), кора в этом месте отмирает и отпадает, обнажая древесину. Солнечные ожоги чаще всего встречаются у плодовых деревьев.

Заболевание сеянцев хвойных и лиственных древесных пород, известное под названием «ожог» или «опал шейки», вызывается сильным нагреванием почвы, температура которой в ясные солнечные дни достигает +55°С. Такая температура является гибельной для проростков и сеянцев лиственных пород. Горячая почва обжигает корневую шейку сеянцев, вызывая их полегание и отмирание.

Заболевание и отмирание растений может быть вызвано недостатком или избытком влаги в почве. В летнее время на сухих почвах происходит увядание сеянцев лиственных пород, а у взрослых деревьев наблюдается увядание, засыхание и опадение листьев. В некоторых случаях недостаток влаги приводит к усыханию вершин деревьев. Угнетение роста и засыхание могут быть вызваны и излишней влажностью почвы, например на болотах и заболоченных участках, так как в этих случаях доступ кислорода к корням затруднён.

Заболевания непаразитарного происхождения не могут передаваться от одного растения к другому. Поэтому непаразитарные заболевания называются неинфекционными, незаразными. Однако почти при всех таких заболеваниях создаются условия (ослабленность растений, наличие ран), благоприятные для проникновения и развития паразитных организмов в тканях растений.

Болезни паразитарные.

Болезни паразитарные

Паразитарные заболевания вызываются грибами, бактериями, некоторыми паразитическими цветковыми растениями и вирусами. Они передаются от одного растения к другому и могут вызвать массовые заболевания (эпифитотии), причиняющие значительный ущерб насаждениям.

Паразитарные заболевания растений представляют сложный патологический процесс, являющийся следствием взаимоотношений паразита с питающим растением. Результат этих взаимоотношений, т. е. развитие болезни и исход её, зависит от вида растения, его состояния, активности возбудителя и воздействия внешней среды. Не все растения одинаково подвержены заболеваниям и реакция их на внедрение и распространение паразита также разная. Есть растения устойчивые к одним заболеваниям (а также к повреждениям вредителей) и неустойчивые к другим.

Свойство растения противостоять заражению называется устойчивостью, или иммунитетом, а способность заражаться — восприимчивостью. Устойчивость и восприимчивость растения к болезням является наследственным свойством, которое в процессе развития организма может меняться под влиянием внешней среды.

Устойчивость определяется особенностями живой клетки растения. Большую роль в этом играют анатомические и морфологические особенности растения, наличие ответной реакции растения на внедрение и распространение паразита в его тканях.

При ответных реакциях растение может выделять токсины, убивающие клетки вокруг внедрившегося паразита, и этим изолировать его. Некоторые растения при ответной реакции образуют вещества — антитела, уничтожающие паразита.

Устойчивость растений к заболеваниям или вредителям изменяется в зависимости от возраста растения, фазы его развития и состояния.

Воздействием внешних условий можно значительно повысить пли понизить устойчивость растений к вредителям и болезням.

Чем благоприятнее условия для развития растений, тем устойчивее они будут к вредителям и болезням.

Устойчивые или иммунные растения можно создавать путем отбора и селекции.

Распространение болезней растений осуществляется воздушными течениями, водой, животными (включая насекомых), деятельностью человека. Источником сохранения инфекции являются заражённые растения, их остатки, семена и почва.

Грибы как возбудители болезней растений.

Грибы как возбудители болезней растений

Грибы принадлежат к низшим растениям. Они не имеют хлорофилла и не способны к самостоятельному (автотрофному) питанию, поэтому они питаются готовыми органическими веществами, поселяясь на живых растениях или их остатках.

Грибы, живущие исключительно за счет живых клеток растений, называются облигатными или чистыми (полными) паразитами (например, мучнисторосяные).

Грибы, питающиеся только мёртвыми тканями растений, называются сапрофитами (домовые грибы и многие плесневые грибы).

Однако большая часть грибов—возбудителей болезней растений относится к факультативным паразитам, то есть обычно они живут за счёт мёртвых тканей растений, но могут развиваться и на живых растениях (серая плесень семян, опёнок).

Факультативными сапрофитами являются грибы, живущие в основном как паразиты, но способные продолжать развитие и на мёртвом субстрате.

Существуют ещё микоризные грибы, сожительствующие с корнями высших растений. Мицелий этих грибов обволакивает корни растений и способствует получению из почвы питательных веществ. Микориза наблюдается главным образом у древесных растений, имеющих короткие сосущие корешки (дуб, сосна, лиственница, ель).

Бактерии как возбудители болезней растений.

Бактерии как возбудители болезней растений

Бактерии представляют бесхлорофильные мельчайшие одноклеточные растительные организмы. Для своего питания они используют только готовые органические вещества живых или мёртвых тканей растений. При благоприятных условиях бактерии быстро размножаются путём деления клеток.

Бактерии находятся повсюду — в воздухе, в почве, на растениях. Среди них имеются полезные и вредные виды. К последним относятся и фитопатогенные бактерии, вызывающие заболевание растений.

Бактерии проникают в растения через устьица, чечевички, уколы насекомых и поранения. Для развития бактерий оптимальной является температура +18 — +30°С; размножению их, распространению и заражению ими растений благоприятствует повышенная влажность воздуха и почвы.

Распространение бактерий происходит при помощи насекомых, воды, ветра, дождя, а при уходе за растениями — и человеком. Перезимовывают бактерии в корнях, корнеплодах, семенах, растительных остатках и в почве, откуда весной они вновь попадают на здоровые растения. Бактерии сохраняют жизнеспособность до 3—4 лет.

Бактериальные болезни проявляются в виде гнилей, увядания, пятнистостей, наростов и камедетечений. Из бактериальных заболеваний зелёных насаждений широко распространены рак яблони, груши, виноградной лозы, ивы, герани, черноплодной рябины и пятнистости листьев многих растений.

Вирусы как возбудители болезней растений.

Вирусы — это мельчайшие живые неклеточные белковые тела, вызывающие инфекционные заболевания человека, животных и растений.

Вирусы являются облигатными паразитами, их жизнедеятельность может протекать только в живых клетках растений.

Вирусные болезни растений чаще всего проявляются в виде мозаики и желтухи.

Мозаика.

Мозаика

При этом заболевании листья приобретают пёструю (мозаичную) расцветку, в них происходит уменьшение хлорофилла, уплотнение клеток губчатой паренхимы, исчезновение межклеточных пространств, уменьшение клеток палисадной паренхимы. Все эти нарушения вызывают ослабление роста и развития растения.

Желтуха.

Желтуха

Вызывает хлороз, деформацию и угнетение растений, на листьях появляются жёлтые пятна и полосы.

Сохраняются вирусы в основном в живых тканях многолетних растений, в семенах, в луковицах, клубнях, корнеплодах и корнях растений. Заражение растений вирусами и распространение болезни происходит главным образом через насекомых, переносящих инфекцию от больных растений к здоровым при питании, а также при соприкосновении больных растений со здоровыми, при прививках, подрезке, уходе за растениями, больными семенами, луковицами, клубнями и корнями.

Такие болезни, как мозаика листьев розы и тополя, инфекционный хлороз жасмина, жимолости, наносят значительный ущерб в зелёном строительстве.

Растения—паразиты.

Паразиты из цветковых растений относятся к высшим растениям, однако в связи с паразитическим образом жизни корневая система у них развита слабо или её совсем нет. Эти растения имеют присоски — особые выросты, которыми они присасываются к растению—хозяину и перехватывают у последнего воду и растворённые в ней питательные вещества. Поражённые растения отстают в росте, плохо плодоносят, а иногда усыхают.

К наиболее известным из этой группы относятся повилика и омела.

Повилика (лат. Cuscuta).

Повилика

Вьющееся, незелёное однолетнее или многолетнее растение, не имеющее корней и листьев. Цветки мелкие белые или розовые. Стебель красноватый или желтоватый, простой или ветвистый, с особыми отростками, называемыми присосками, или гаусториями. Гаустории внедряются в ткани растения—хозяина и перехватывают необходимые для себя питательные вещества.

Повилика поражает многие растения, из древесных и кустарниковых пород она поражает тополь, дуб, ясень, акацию, лох, иву. У поражённых растений уменьшается прирост, снижается плодоношение и в течении 1—2 лет они усыхают.

Омела (лат. Viscum).

Омела

Относится к многолетним кустарникам с вечнозелёными или опадающими на зиму листьями. Паразитирует на ветвях деревьев и кустарников. Плоды — сочные ягоды, поедаются некоторыми птицами, что обеспечивает распространение паразита. На ветвях растения—хозяина семена омелы прорастают, образуя корневые и воздушные побеги.

Диагностика болезней растений и современные технологии

22 августа 2013

Диагностика болезней растений и современные технологии

  • 5437
  • 3,8
  • 0
  • 0

Добавить в избранное print
Обзор

Иллюстрация с обложки книги Ю.Т. Дьякова «О болезнях растений»

Автор
Редакторы
  • «Био/мол/текст»-2013
  • Биология
  • Биотехнологии

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Фитопатология — это наука о болезнях растений, о том, как с этими недугами бороться и предупреждать их возникновение. Чтобы побеждать болезни, надо их правильно, точно и своевременно диагностировать. Есть много методов такой диагностики; в последние десятилетия, с развитием молекулярных методов анализа, активно разрабатываются всё новые и новые, постепенно вытесняя из практики классические подходы. О трудностях диагностики болезней растений и об основных путях их преодоления и будет рассказано в этой статье.

Конкурс «био/мол/текст»-2013

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Лучший обзор».

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Чем болеют растения?

Для начала несколько слов о том, от чего, собственно, специалистам приходится защищать сельскохозяйственные растения. Причинами заболевания растений могут быть как факторы среды (летняя засуха или зимние морозы, недостаток питательных веществ в почве или их избыток и т.п.), так и различные паразитические организмы (бактерии, вирусы, грибы, круглые черви (нематоды) и даже другие растения).

Грибы, бесспорно, являются основными патогенами культурных растений. Известно, например, что из 162 серьёзных заболеваний в Центральной Европе 135 (83%) вызываются грибами [2]. Фитопатогенные грибы — многочисленная группа; их описано свыше 10 000 видов, различных по систематическому положению, степени паразитизма, специализации и т.д. [3]. Они широко распространены в природе и при благоприятных для их развития условиях наносят значительный урон урожаю и сельскохозяйственным продуктам при хранении. Даже самые осторожные оценки говорят об уничтожении болезнями 10–20% потенциального урожая; без контрмер масштабы этих потерь резко возросли бы [2].

Именно о проблемах диагностики болезней растений, вызываемых фитопатогенными грибами, пойдёт речь в данной статье.

Врага надо знать в лицо

Зачем же нужно, с одной стороны — обнаружение, а с другой — быстрое и точное (желательно — до вида, или даже расы) определение фитопатогенных грибов?

На данный момент самым распространённым методом борьбы с фитопатогенными грибами является обработка растений фунгицидами. Понятно, что невозможно защитить культуры от всех возможных потенциальных угроз: это и сложно, и экономически невыгодно, да и для окружающей среды далеко не полезно. Именно поэтому важно знать, желательно — своевременно, с чем именно придётся бороться. Чем раньше обнаружена болезнь, тем больше шансов, что, приняв соответствующие меры, удастся её победить. Это верно для заболеваний как человека, так и растений. Кстати, точное определение вида грибов важно ещё и в довольно неожиданной области — реставрации деревянных строений — поскольку используемые там антисептические меры также очень сильно зависят от типа поражения [4].

Кроме этого, идентификация фитопатогенных грибов необходима для изучения их таксономии и эволюции, их взаимоотношений с растениями-хозяевами, генетических основ восприимчивости и устойчивости растений, что, в конечном счете, должно помочь в разработке способов борьбы с патогенами и в селекции растений, невосприимчивых к болезням [5].

И, наконец, крайне важна сертификация зерна и посадочного материала в рамках карантинных программ. Известно, что фитопатогенные грибы могут распространяться многими путями — как естественными (с током воздуха, водой, насекомыми, животными), так и при помощи человека, перевозящего заражённые растения или их части не только между различными странами, но и между континентами. Зачастую такое перемещение приводит к неожиданному и масштабному распространению заболеваний.

Например, пузырчатая ржавчина (Cronartium ribicola) была эндемична для Альп и востока России. Этот паразит, в цикле развития предполагающий обязательную смену хозяев, обитает круглый год на пятихвойных соснах, а летом поражает листья смородины; ни в одном из исходных ареалов он не причинял серьёзного ущерба. Однако веймутова сосна, завезённая в начале XVIII века из Америки в ряд областей Европы, оказалась крайне восприимчивым хозяином для данного гриба. За счёт этого распространившаяся инфекция причинила большой вред культурам смородины и высаженным веймутовым соснам, а в 1909 году была завезена с их рассадой в Америку, где встретила многочисленных хозяев для обеих фаз развития. Здесь стали страдать, прежде всего, лесообразующие пятихвойные сосны. Поэтому, чтобы разорвать инфекционную цепь паразита с обязательной сменой хозяев, пытаются уничтожать дикорастущие виды смородины [2].

Ещё один показательный пример: возбудитель голландской болезни вяза (Ophiostoma ulmi) уже в XX столетии был занесён из континентальной Европы в Северную Америку. Начиная примерно с 1970 г., после того, как он был завезён в Великобританию, он успел уничтожить половину английских вязовых насаждений [2]. Теперь этот вид встречается и в России.

Для того чтобы избежать подобного впредь, созданы списки карантинных организмов, и при перемещении растений или их семян между странами (или даже частями одной страны) обязательно проводится их обследование.

«Классические» методы диагностики и трудности в их применении

Как только что было показано, идентификация фитопатогенных грибов крайне важна, возник вопрос — каким образом она производится?

Наиболее простой способ — это идентификация патогена по внешним признакам заболевания (симптомам), то есть по тому воздействию, которое он оказывает на поражённое растение [6]. Но здесь проблема в том, что к одним и тем же повреждениям растения-хозяина могут приводить совершенно разные микроорганизмы, отличающиеся разной устойчивостью к фунгицидам, вредоносностью и другими характеристиками. Как пример, здесь можно привести три листовые пятнистости пшеницы (рис. 1).

Листовые пятнистости пшеницы

Рисунок 1. Листовые пятнистости пшеницы. Слева — септориоз листьев пшеницы (возбудитель — Mycosphaerella graminicola). По центру — септориоз листьев и колоса пшеницы, проявление на листьях (возбудитель — Phaeosphaeria nodorum). Справа — жёлтая пятнистость пшеницы (возбудитель — Pyrenophora triticirepentis). Обратите внимание: несмотря на то, что это разные заболевания, поражения листьев очень похожи.

Ещё одна проблема заключается в том, что далеко не все заболевания проявляются сразу же после заражения растения. Например, возбудитель пыльной головни ячменя (Ustilago nuda) обычно проникает во время цветения пшеницы в формирующуюся зерновку. Гриб не препятствует формированию зародыша, само зерно развивается нормально, ничем внешне не отличаясь от здорового. Мицелий зимует в зерновке. Весной одновременно с прорастанием семян происходит и рост мицелия, который по мере роста растения распространяется по различным его органам. Проявляется заболевание только в период колошения. При этом разрушаются все части колоса, превращаясь в чёрную споровую массу, после распыления которой остаются лишь ости и стержень колоса (рис. 2) [8].

Пыльная головня ячменя

Рисунок 2. Пыльная головня ячменя: поражённое соцветие со спорами

Стандартный для фитопатологов подход при определении фитопатогенных грибов — это выделение их в чистую культуру на какой-либо питательной среде, получение характерных образований (чаще всего это, конечно, спороношения) и затем идентификация гриба под микроскопом.

Но здесь возникают определённые трудности. Основная из них заключается в том, что далеко не все паразитические грибы возможно культивировать на искусственных питательных средах: многим требуется наличие живых тканей растения-хозяина, либо присутствие других представителей сложного сообщества [10]. Но даже если гриб удаётся выделить в культуру, следующий вопрос — это то, сколько времени понадобится, чтобы добиться от него появления спороношения. Например, возбудитель белосоломенной болезни пшеницы и ржи (Gibellina cerealis), хотя и хорошо культивируется, даёт спороношение только после четырёх–пяти недель роста. Естественно, что меры по борьбе с патогеном необходимо принимать сразу после его обнаружения, а не через месяц, когда может оказаться, что спасать уже нечего.

Сравнение конидий типовых образцов

Рисунок 3. Сравнение конидий типовых образцов Alternaria longipes (вверху), Alternaria tenuissima (в центре), Alternaria alternata (внизу). Видно, что на основе сравнения только формы конидий этих трёх видов однозначно различить их крайне сложно. При идентификации видов в данном случае специалист использует не только форму конидий, но и другие признаки (например, способ образования конидий, их взаимное расположение и т.п.).

И даже с определением тех фитопатогенных грибов, спороношения которых получить сравнительно просто, могут возникать сложности. К примеру, идентификация многих микромицетов сопряжена с рядом трудностей, таких как сходство морфологических характеристик разных видов и одновременно внутривидовая вариабельность признаков. Несмотря на внешнее сходство, возбудители могут значительно отличаться по патогенности, токсигенности, степени специализации, генетике взаимоотношений с растением-хозяином, вредоносности, чувствительности к фунгицидам и т.д. То есть разные виды обладают совершенно разными экологическими особенностями и хозяйственной значимостью [12]. Хорошим примером здесь является определение различных видов рода Alternaria (рис. 3). Очевидно, что для идентификации до вида нужны достаточно широкие познания в данной области и немалый опыт работы с исследуемым фитопатогеном.

Ещё один способ, пригодный для обнаружения некоторых фитопатогенных грибов, заключается в смыве с субстрата, фильтрации и микроскопическом определении (и даже подсчёте, что даёт количественные данные) их спор. Чаще всего, таким способом оценивается количество грибных спор в зерне или в почве. Несмотря на то, что идентификация до вида на основании одних только спор чаще всего затруднена, этот способ широко применяется, а для анализа получаемых при помощи микроскопа изображений разрабатываются специальные компьютерные программы [14]. Например, таким образом определяют заражённость зерна возбудителем твёрдой головни (Tilletia caries) (рис. 4) [15]. Несмотря на использование компьютерных технологий, этот метод весьма трудоёмок и не подходит для исследования большого количества образцов.

Зерновки, поражённые твёрдой головнёй пшеницы

Рисунок 4. Зерновки, поражённые твёрдой головнёй пшеницы

Молекулярная биология на службе фитопатолога

Во всех описанных случаях на помощь исследователям могут прийти широко развивающиеся в последнее время молекулярные методы анализа. Сейчас в основе большинства из них лежит применение ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, иммуноферментный анализ) [11], либо ПЦР (полимеразная цепная реакция, polymerase chain reaction) [17].

Иммуноферментный анализ состоит из двух основных этапов: иммунной и ферментативной реакций. Иммунная реакция заключается в специфическом связывании характерного для данного микроорганизма антигена с диагностическим антителом. Ферментативная реакция необходима для обнаружения этого связывания. Как правило, она сопровождается изменением цвета, причём степень этого изменения может быть использована для определения количества присутствующего антигена.

Есть много модификаций данного метода, бóльшая часть из которых применяется для обнаружения возбудителей болезней растений [16]. Особенно интересен так называемый «lateral flow assay» (анализ капли, растекающейся в радиальном направлении) (рис. 5), отличающийся высокой скоростью анализа и не требующий никакого специального оборудования или знаний. Используя такой набор (имеющий карманный формат), можно провести анализ непосредственно «в поле», так что не нужно даже отправлять образцы в лабораторию.

Прибор CSL Pocket Diagnostic

Рисунок 5. Прибор CSL Pocket Diagnostic TM lateral flow immunodiagnostic kit. Растительный экстракт помещается на площадку (a), которая содержит латексные шарики, покрытые специфическими антителами; смесь мигрирует вдоль мембраны (b) к абсорбирующей поверхности (c). При этом имеющиеся в растворе целевые антигены связываются со специфичными антителами на латексных шариках. Мембрана содержит полосу антител, отличающихся необходимой специфичностью (измерительную полосу) (d) и полосу других антител, которые связываются с первыми антителами (контрольную полосу) (e). Латексные шарики, содержащие связанный антиген, задерживаются в тестовой зоне, давая видимую линию, тогда как излишние латексные шарики, которые не содержат антигена, задерживаются в контрольной зоне, показывая, что анализ работает. Наличие двух линий соответствует положительному результату (positive), наличие только одной линии (контрольной) говорит о негативном результате (negative).

Основанные на иммуноферментном анализе методы широко применяются для обнаружения вирусов (в том числе поражающих растения) и значительно реже — для идентификации грибов и бактерий. Основной причиной этого является трудность получения антител с необходимой специфичностью: строение клеточных стенок грибов и бактерий гораздо сложнее, чем вирусного капсида, к тому же может изменяться в ходе их жизненного цикла. В результате получаемые антитела могут оказаться специфичны как сразу к большой группе видов, так и исключительно к отдельным жизненным формам данных микроорганизмов. Тем не менее, основанные на ELISA методы идентификации фитопатогенных грибов всё же разрабатываются: например, существует метод идентификации спор уже упоминавшейся в данной статье твёрдой головни [19].

ПЦР — это ферментативная реакция, в результате которой происходит накопление большого количества копий какого-либо не слишком большого (чаще всего, 200–1500 пар нуклеотидов) фрагмента ДНК. Так как ДНК любого организма содержит как вариабельные (отличающиеся даже у близкородственных организмов), так и консервативные (сходные у эволюционно далёких видов) участки, возможно на основе выбора диагностического участка варьировать специфичность протекающей реакции.

Таким образом, данный метод позволяет обнаруживать последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для конкретного организма или группы сходных организмов и, тем самым, выявлять его (их) присутствие в анализируемой пробе. Методы, основанные на ПЦР, позволяют идентифицировать патогенные виды как в чистой культуре, так и непосредственно в растительном материале, минуя этап изоляции грибов [20]. Как пример, здесь приведены результаты ПЦР, разработанной для идентификации грибов рода Pyrenophora (рис. 6), представители которого являются возбудителями жёлтой пятнистости злаков, в частности — пшеницы (рис. 1).

Идентификация грибов рода Pyrenophora

Рисунок 6. Разделённые при помощи электрофореза продукты ПЦР, разработанной для идентификации грибов рода Pyrenophora. М — маркер, представляющий собой набор фрагментов ДНК известного размера, 1–10 — ДНК, выделенная из различных образцов листьев пшеницы, поражённых листовыми пятнистостями. Здесь продукт реакции (фрагмент ДНК известного размера) должен наблюдаться только в том случае, если в образце присутствует ДНК целевого организма, а именно — гриба рода Pyrenophora. В итоге видно, что растения под номерами 3–6, 8 и 9 больны жёлтой пятнистостью, а остальные — каким-либо другим внешне схожим заболеванием.

Существует достаточно много модификаций метода ПЦР, большинство из которых применяется в изучении возбудителей болезней растений. Например, RAPD и RFLP анализы используются для уточнения родственных связей между различными грибами; ПЦР, специфичная для ДНК представителей отдельных родов или видов — для идентификации фитопатогенов (в том числе — в форматах nested и multiplex); ПЦР с регистрацией в режиме реального времени (real-time PCR) — для определения количества присутствующей целевой ДНК.

Рассмотрим подробнее один из самых перспективных методов на основе ПЦР — ПЦР с регистрацией в режиме реального времени (рис. 7). В отличие от большинства других форматов ПЦР, он позволяет не только констатировать факт присутствия ДНК целевого патогена, но и измерить её количество. В качестве примера здесь приведено определение в двух образцах количества ДНК ещё одного возбудителя листовой пятнистости.

ПЦР с регистрацией в режиме реального времени

Рисунок 7. ПЦР с регистрацией в режиме реального времени. В ходе реакции непрерывно измеряется флуоресценция пробы (Fluorescence Signal), которая увеличивается по мере накопления продукта реакции (время реакции здесь выражено в числе циклов реакции — Cycle Number). Чем больше целевой ДНК было в смеси на момент начала реакции, тем быстрее происходит накопление продукта, и, соответственно, тем меньше будет номер цикла (cycle threshold, Ct), при котором флуоресценция пробы достигнет порогового значения (Detection threshold). Количество ДНК в исходной пробе определяют по калибровочному графику (приведён на вставке), соотносящему исходное количество целевой ДНК (Quantity) со значениями Ct. В данном случае на графике показано изменение во времени флуоресцентного сигнала для двух образцов, содержащих ДНК Mycosphaerella graminicola (рис. 1), причём кривая «а» соответствует образцу с большей концентрацией.

Интересно применение данного метода для анализа заражённости зерна твёрдой головнёй (рис. 4): при наличии соответствующих калибровочных графиков возможно получение результатов в виде числа спор, имеющихся в образце [7].

Ложка дёгтя в бочке мёда

Хотя преимущества и перспективы применения молекулярных методов идентификации сложно переоценить, на пути их практического использования имеется целый ряд трудностей. Несмотря на универсальность методов при конечном анализе, для их разработки и проверки требуется достаточно много времени и немалая экспериментальная база. Основной проблемой здесь является отсутствие возможности чисто теоретически оценить специфичность разрабатываемых методов.

Ещё одна сложность является прямым следствием высокой чувствительности данных методов (особенно — основанных на ПЦР). Ведь если анализ позволяет выявить в образце присутствие даже одной споры фитопатогенного гриба, или всего лишь нескольких копий его ДНК, то и для получения ложноположительного результата оказывается достаточно даже минимального загрязнения изначально «чистого» образца. Следовательно, требования к стерильности оказываются крайне высоки на всех стадиях анализа, но всё равно всегда приходится использовать отрицательные контроли.

Ну и самая большая проблема всех описанных в данной статье методов — это цена, ограничивающая их широкое применение в условиях небогатых российских хозяйств.

Несколько слов о будущем

Несмотря на все имеющиеся проблемы, молекулярные методы анализа интенсивно развиваются (о чём можно судить хотя бы по числу публикаций на соответствующие темы, которое с каждым годом становится всё больше). Старые методы постоянно совершенствуются, в то же время разрабатываются новые (например, метод биочипов [21] и секвенирование следующего поколения [22]), а цена одного анализа становится всё ниже. Поэтому можно надеяться, что не за горами то время, когда все упоминавшиеся в данной статье методики и их более совершенные аналоги действительно найдут широкое применение и облегчат жизнь фитопатологов и агрономов.

https://semku.ru/article/bolezni-rasteniy
https://biomolecula.ru/articles/diagnostika-boleznei-rastenii-i-sovremennye-tekhnologii

Оставить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

X